Здесь мы опишем экономически эффективный способ органотипической культуру взрослой сетчатке свиней в течение семи дней. Короче говоря, стерильной фильтровальной бумаги была использована для лифта нейронных сетчатку от от ПЭС и место фоторецепторов вверх на вставке поднятых на заказ стенда.

В этом видео мы описываем протокол органотипической культуры полной толщины взрослого ци и сетчатки. На этом мультфильме показана общая процедура. Во-первых, удалите передний отрезок взрослого свиного глаза.

С помощью шестимиллиметрового дерева найдите лезвие, чтобы сделать эксплан на всю толщину от заднего полюса. Аккуратно приложите лист стерильной бумаги к ганглиозной клеточной стороне сетчатки. Тщательно отшелушите сетчатку от пигментного эпителия сетчатки.

Поместите фоторецептор комплекса сетчатки с фильтровальной бумагой стороной вверх на вкладыш для чашки для клеточных культур, которая лежит на специально изготовленной подставке внутри чашки для культивирования. Чтобы сделать подставку, пятимиллиметровый наконечник пипетки был отрезан у основания, чтобы полый цилиндр длиной шесть миллиметров, а затем были удалены кусочки сбоку цилиндра, чтобы создать три ножки. Затем вставка помещается внутрь подставки для создания стабильного комплекса.

Культуральный вкладыш и базовый комплекс собирают, помещают внутрь культуральной чашки и заполняют средой для покрытия фильтра клеточной культуры. Вставка. Стерильные фильтры для культур получают методом автоклавирования фильтровальной бумаги Ватмана. Свиные глаза получают на местной скотобойне в течение трех часов после жертвоприношения животных.

Это инструменты, необходимые для вскрытия. Для лучшей визуализации сетчатки используется препарирующий микроскоп. Посторонняя ткань обрезается с глазного яблока.

Глаз обмакивают в Бетадин и промывают стерильным ирригационным раствором. Марлю БССА два на два увлажняют. Зрительный зрительный нерв аккуратно обрезается.

Лезвием делается надрез на четыре-пять миллиметров. Изогнутые ножницы используются для того, чтобы сделать кольцевой разрез в месте соединения между цилиарным телом и нервной сетчаткой. Передний сегмент вместе со стекловидным телом удаляются, оставляя нервную сетчатку на заднем полюсе.

Шестимиллиметровая мелочь дерева используется для того, чтобы сделать полную толщину эксплана через задний столб. Стерильная фильтровальная бумага аккуратно наносится на сторону ганглиозных клеток сетчатки. После того, как фильтровальная бумага полностью увлажнена, сетчатка отделяется от нижележащего слоя RP путем отслаивания фильтровальной бумаги, Фильтр-бумага образует комплексы сетчатки, и помещается чуть ниже уровня питательной среды в подготовленную вкладыш для чашки для культивирования.

Вот как устроена культура. Вот условия для выращивания. После четырех дней культивирования эксплан сетчатки свиньи остается плоским на фильтровальной бумаге.

Вот четырехдневный план сетчатки без фильтровальной бумаги для руки был зафиксирован и разрезан либо криостатом, либо виомом. После фиксации сетчатка отделяется от фильтровальной бумаги с помощью шпателя, для замороженных срезов удаляется лишняя жидкость. Сделайте квадратную блочную рамку с помощью стоматологического воска.

Поместите его вокруг шестимиллиметрового контура сетчатки и погрузите все в тканевый технологический ОКТ-состав. После того, как блок образца полностью заморожен, его помещают на криостатную платформу для образцов. Вертикально я сам беру образец платформы, чтобы убедиться, что блок расположен вертикально к лезвию.

Удалите зубной воск и начните делать срезы нужной толщины, поместите срезы на обработанные желатином предметные стекла, чтобы разрезать сетчатку глаза вибрирующим микротомом. Эксплант погружен в 4%-ный агар. 4%агар растапливают на кипящей водяной бане и пересыпают в небольшую пластиковую емкость.

Когда образец сетчатки охлаждается примерно до 50 градусов по Цельсию, его погружают в расплавленный агар с помощью шпателя. Блок агара затвердевает при четырех градусах Цельсия и нарезается на небольшой кубик. Когда сетчатка находится посередине, блок приклеивается к сцене вибрама.

С помощью сумасшедшего клея сетчатка монтируется таким образом, что она находится под углом 90 градусов к лезвию Vibram. Срезы толщиной 50 микрон переносили под водой на предметное стекло с помощью иммуногистохимии мягкой кистью. Для синаптического везикулярного белка два глиальных фибриллярных кислых белка проводится по любому стандартному протоколу.

Срезы также были окрашены йодидом пропидия. Для ядерной визуализации иммуномеченые срезы просматривают с помощью конфокального микроскопа. Вот помеченные иммуно грубые мертвые секции.

Временами в ноль, в четыре дня, в семь дней структура участка сетчатки все еще остается неповрежденной. Культивируемая сетчатка свиньи имеет потенциал для многих различных типов исследований. Между сетчаткой свиньи и сетчаткой глаза человека есть много общего.

Поэтому, когда высококачественная сетчатка человека становится легкодоступной, можно предположить, что аналогичные методы могут быть применены для изучения ее морфологии и функциональности. Более подробная информация представлена в рукописи.