Qui si descrive una soluzione economica per la cultura tecnica organotipica di retina suini adulti per sette giorni. In breve, una carta sterile filtro è stato usato per sollevare la retina neurale fuori dal RPE e fotorecettori lato posto su un inserto sollevata da una misura stand.

In questo video, descriviamo un protocollo per la coltura organotipica di cellule e retina adulte a tutto spessore. Questo cartone animato mostra la procedura generale. Innanzitutto, rimuovi il segmento anteriore dell'occhio di maiale adulto.

Usa un albero di sei millimetri, trova la lama per fare un explan a tutto spessore dal polo posteriore. Attacca delicatamente un pezzo di carta sterile al lato delle cellule gangliari della retina. Staccare con cura la retina dall'epitelio pigmentato retinico.

Posizionare il fotorecettore del complesso retina di carta da filtro con il lato rivolto verso l'alto su un inserto per piastre di coltura cellulare, che poggia su un supporto su misura all'interno di un piatto coltivato. Bene, il supporto migliora l'apporto di ossigeno e nutrienti per la retina consentendo più spazio per il mezzo sotto il campione Per fare un supporto, una punta di pipetta da cinque millimetri è stata tagliata vicino alla base per produrre un cilindro cavo lungo sei millimetri, quindi i pezzi sono stati rimossi dal lato del cilindro per creare le tre gambe. L'inserto viene quindi posizionato all'interno del supporto per creare un complesso stabile.

L'inserto di coltura e il complesso di base vengono assemblati, posti all'interno di una piastra di coltura e riempiti con terreno per coprire il filtro della coltura cellulare. Inserire. I filtri di coltura sterili sono preparati mediante autoclave della carta da filtro Watman. Gli occhi di maiale vengono ottenuti da un macello locale entro tre ore dal sacrificio animale.

Questi sono gli strumenti necessari per la dissezione. Un microscopio da dissezione viene utilizzato per visualizzare meglio la retina. Il tessuto estraneo viene tagliato dal bulbo oculare.

L'occhio viene immerso in Betadine e lavato via con una soluzione irrigua sterile. La garza BSSA due a due viene inumidita. Il nervo ottico ottico viene accuratamente tagliato.

Viene praticata un'incisione da quattro a cinque millimetri con una lama. Le forbici curve vengono utilizzate per eseguire un taglio circonferenziale vicino alla giunzione tra il corpo ciliare e la retina neurale. Il segmento anteriore insieme al vitreo vengono rimossi lasciando la retina neurale nel polo posteriore.

Un albero fine di sei millimetri viene utilizzato per fare explan a tutto spessore attraverso il polo posteriore. Una carta da filtro sterile viene applicata con cura sul lato delle cellule gangliari della retina. Una volta che la carta da filtro è completamente inumidita, la retina si separa dallo strato di RP sottostante staccando la carta da filtro, i complessi di retina della carta da filtro e viene posizionata appena sotto il livello del terreno di coltura nell'inserto del piatto di coltura preparato.

Ecco la configurazione della cultura. Ecco le condizioni colturali. Dopo quattro giorni di coltura, l'explan retinico suino rimane piatto sulla carta da filtro.

Ecco un explan retinico di quattro giorni senza carta da filtro po la retina della mano è stata fissata e sezionata da un criostato o da un vioma. Dopo la fissazione, la retina si separa dalla carta da filtro usando una spatola, il liquido in eccesso viene rimosso per le sezioni congelate. Crea una cornice a blocchi quadrati usando la cera dentale.

Posizionalo intorno all'explan retinico di sei millimetri e immergi tutto nel composto OCT di tecnologia tissutale. Dopo che il blocco campione è completamente congelato, viene posizionato su una piattaforma di campionamento criostato. Verticalmente la mia piattaforma di campionamento per assicurarmi che il blocco sia verticale rispetto alla pala.

Rimuovere la cera dentale e iniziare ad eseguire il sezionamento allo spessore desiderato, posizionare le sezioni su vetrini trattati con gelatina per tagliare la retina con il microtomo vibrante. L'espianto è incorporato in agar al 4%. L'agar al 4% viene sciolto a bagnomaria bollente e versato in un piccolo contenitore di plastica.

Una volta raffreddato a circa 50 gradi Celsius, il campione di retina viene quindi immerso nell'agar fuso utilizzando una spatola. Il blocco di agar viene solidificato a quattro gradi Celsius e tagliato in un piccolo cubo. Con la retina al centro, il blocco è incollato al tavolino di un vibram.

Usando una colla pazzesca, la retina è montata in modo tale da essere un angolo di 90 gradi rispetto alla lama Vibram. Le sezioni spesse 50 micron sono state trasferite sott'acqua su un vetrino utilizzando un'immunoistochimica a pennello morbido. Per la proteina della vescicola sinaptica vengono eseguite due proteine acide fibrillari gliali utilizzando qualsiasi protocollo standard.

Le sezioni sono state anche colorate con ioduro di propidio. Per la visualizzazione nucleare, le sezioni immunomarcate vengono visualizzate con un microscopio confocale. Ecco le sezioni morte grossolane con etichetta immuno.

A volte zero, a quattro giorni, a sette giorni, la struttura della sezione retinica rimane ancora intatta. La retina di maiale in coltura ha il potenziale per molti tipi diversi di studi. Ci sono molte somiglianze tra la retina del maiale e quella umana.

Pertanto, quando la retina umana di alta qualità diventa prontamente disponibile, presumibilmente tecniche simili possono essere applicate allo studio della sua morfologia e funzionalità. Per maggiori dettagli, si rimanda al manoscritto.