Um método através do qual a express?o do gene no tubo neural pode ser downregulated em um tipo de célula específico forma rastreável é descrito. Demonstramos como

O objetivo deste procedimento é avaliar os defeitos de orienta??o do ax?nio no tubo neural do frango após a regula??o negativa da express?o gênica de maneira rastreável específica do tipo de célula. Isso é feito preparando ovos de galinha fertilizados para eletropora??o innovo, cortando uma janela na casca do ovo. O segundo passo é injetar e eletrooperar constru??es de DNA que codificam microRNAs no tubo neural.

Em seguida, as medulas espinhais eletro s?o dissecadas e fixadas em prepara??es de livro aberto de montagem plana. A etapa final é injetar um corante fluorescente para visualizar as proje??es axonais. Em última análise, a microscopia fluorescente é usada para mostrar as células que experimentam silenciamento de genes e para avaliar os efeitos subsequentes na orienta??o do ax?nio de comissa.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes é o silenciamento específico dos genes do tipo de célula. Para fazer os plasmídeos, verifique o protocolo escrito para obter instru??es: Incube os ovos a 38,5 graus Celsius e cerca de 45% de umidade até que o estágio desejado de desenvolvimento seja alcan?ado. Para estudar a orienta??o axonal dos neur?nios comissurais, incube os embri?es por aproximadamente três dias até atingirem o hambúrguer e o estágio 17 a 18 de Hamilton.

Uma vez atingido o estágio desejado de desenvolvimento e antes que a proteína de interesse seja acumulada dentro do embri?o, remova os ovos da incubadora e coloque-os em uma posi??o horizontal estável por 20 minutos para reposicionar o embri?o em cima da gema na parte superior do ovo. Depois que os embri?es se reposicionarem em cima da gema, retire os ovos da incubadora e limpe-os com etanol a 70%. Em seguida, coloque uma tira de fita adesiva ao longo do eixo longo do ovo e use um bisturi para fazer um pequeno orifício na extremidade cega do ovo e outro no canto da área a ser janelada.

Em seguida, insira uma seringa equipada com uma agulha de calibre 18 no orifício na extremidade romba do ovo em um ?ngulo de 45 graus e aspire aproximadamente três mililitros de albumina, tomando cuidado para evitar danificar a gema. Use uma tesoura pequena segurada horizontalmente para cortar a janela no ovo sem danificar o embri?o. Em seguida, sele a janela usando a fita.

Por fim, use um pincel para aplicar cera de parafina derretida para selar o orifício na extremidade cega do ovo e selar quaisquer rachaduras no ovo da mesma maneira. Em seguida, devolva o ovo à incubadora. Repita o processo com todos os ovos a serem eletroporados.

Remova a fita de um dos ovos com janela e prepare o embri?o de acordo com Hamburger e Hamilton. Em seguida, use uma pin?a para levantar as membranas embrionárias extras da metade cordal do embri?o na regi?o onde as principais veias da linha de viter direita e esquerda Entre no tronco, rasgue ou corte suavemente as membranas com uma tesoura de mola e despeje-as em dire??o à cauda.

Agora use uma suc??o suave para carregar a mistura de DNA a ser eletroporada em um microcapilar de vidro com tubula??o anexada. Insira o microcapilar no canal central do tubo neural logo acima dos membros posteriores e injete a solu??o de DNA controlando o volume de inje??o por via oral. O corante azul deve se espalhar da ponta da cauda até o ventrículo do cérebro em desenvolvimento.

Adicione algumas gotas de PBS estéril no topo do embri?o e coloque os eletrodos paralelos ao eixo ?ntero-posterior do embri?o sem tocar no embri?o ou em quaisquer vasos sanguíneos. Em seguida, segure os eletrodos com firmeza e eletropurado. Após a eletropora??o, remova os eletrodos e enxágue rapidamente com água estéril para remover as proteínas desnaturadas da clara do ovo.

Finalmente, coloque um pouco mais de PBS estéril no embri?o e feche novamente o ovo com fita adesiva. Como antes, a selagem adequada é crucial para evitar a desidrata??o do embri?o. Em seguida, devolva o embri?o à incubadora até que o estágio desejado de desenvolvimento seja alcan?ado.

Quando o embri?o atingir Hamburger Hamilton, estágio 25 a 26, use uma pin?a para remover o embri?o do ovo e coloque-o em uma placa de Petri revestida com elast?mero sil guard. Use a pin?a para remover as membranas embrionárias extras e coloque o embri?o com o lado dorsal voltado para baixo. Agora use alfinetes de insetos de 0,2 milímetro para esticar suavemente e prender o embri?o no pesco?o e na cauda.

Em seguida, prenda os membros do embri?o, inserindo os pinos em um ?ngulo para que n?o interfiram na dissec??o subsequente. Ilumine o prato que contém o embri?o por baixo para que a densidade do tecido possa ser percebida. Use uma tesoura de mola para abrir a cavidade abdominal e raspe suavemente com uma pin?a para remover o cora??o e os órg?os internos.

Quando todos os órg?os forem removidos completamente, as vértebras segmentadas e a medula espinhal estar?o visíveis. Em seguida, gire o embri?o 180 graus e use uma tesoura de mola para fazer um corte raso nas vértebras que recobrem a medula espinhal no pesco?o. Em seguida, fa?a dois cortes longitudinais curtos através das vértebras de cada lado da medula espinhal, do pesco?o à cauda.

Use uma pin?a para levantar as vértebras da palheta da medula espinhal e, em seguida, retire as vértebras em uma única tira em dire??o à cauda. Em seguida, estique suavemente e prenda novamente o embri?o através da cauda e dos membros. Agora identifique as meninges da medula espinhal, que devem aparecer como uma linha escura e densa de tecido entre o tubo neural e os g?nglios da raiz dorsal e, em seguida, use uma agulha ster ou bisturi microcirúrgico fino para cortar as meninges longitudinalmente ao longo de cada lado da medula do pesco?o à cauda.

As meninges devem se separar facilmente da medula espinhal devido ao alongamento do embri?o fixado. Finalmente, corte a medula espinhal ao nível do bot?o da asa e o cord?o ao bot?o do membro. Em seguida, use uma pin?a para levantar a medula espinhal em um movimento cordal rostral, garantindo que a medula permane?a imersa no PBS First.

Espalhe a medula espinhal isolada em uma espátula e transfira-a para um prato revestido de syl guard fresco contendo 4% de formaldeído em PBS. Em seguida, prenda cuidadosamente a medula espinhal medialmente e trimestralmente com pinos de insetos de 0,1 milímetro para produzir uma prepara??o de montagem plana, incubando o paraldeído por 30 minutos a uma hora. Tenha cuidado para n?o corrigir demais.

Como isso aumentará o fundo e reduzirá a eficiência da difus?o do diodo. Em seguida, despeje cuidadosamente o paraldeído e substitua por PBS. Depois de preparar cinco miligramas por mililitro rápido di em etanol, quebrar a ponta de uma micropipeta de vidro de pequeno di?metro ligada a um tubo de plástico e puxar a solu??o para a pipeta.

Insira a agulha cheia em um prato de PBS e verifique se o corante n?o vaza da agulha. Se isso acontecer, o di?metro é muito grande e uma nova agulha deve ser preparada. Certifique-se de que a prepara??o do livro aberto seja iluminada por baixo e localizada faixa longitudinal mais densa de tecido localizada aproximadamente um quinto da largura do livro Hemi Da borda lateral, os corpos celulares dos neur?nios comissurais s?o apenas dorsais a essa linha escura.

Insira a ponta da micropipeta de vidro no tecido e, à medida que a agulha é retirada, sopre uma pequena quantidade de olho D usando uma pipeta de boca trabalhando rapidamente repita o procedimento a cada 0,5 milímetros ao longo do comprimento do livro aberto. Quando as inje??es estiverem concluídas, use uma pipeta de transferência para aspirar e descartar. Qualquer excesso di falha em fazê-lo resultará em fundo alto.

Repita o procedimento para todas as prepara??es de livro aberto. Em seguida, coloque o prato contendo as prepara??es injetadas de quatro graus Celsius por aproximadamente três dias para permitir que o corante se espalhe ao longo dos ax?nios. Após este tempo, monte os preparativos de acordo com as instru??es do protocolo escrito.

Se??es transversais e livros abertos foram derivados de embri?es de galinha do Estágio 25 a 26 do Hamburger Hamilton que foram eletroclassificados no Estágio 18 do Hamburger Hamilton. Como visto aqui na se??o transversal, o promotor de a??o beta impulsiona a express?o onipresente. A seta indica a dire??o ventral dorsal.

Esta imagem mostra um exemplo de padr?es de express?o de proteínas fluorescentes obtidos após a eletropora??o dos vetores plasmidiais. Aqui, a express?o onipresente do promotor beta actina é vista em uma prepara??o de livro aberto. A seta indica a dire??o do cord?o rostral.

Esta imagem mostra uma se??o transversal após a eletropora??o com uma constru??o contendo um intensificador matemático. Isso impulsiona a express?o em neur?nios individuais. Aqui, a express?o da constru??o matemática de um intensificador é vista em uma prepara??o de livro aberto.

Esta se??o transversal mostra a express?o do falc?o, um intensificador após eletropora??o bilateral da constru??o. O falc?o Um intensificador impulsiona a express?o especificamente na placa do piso. Esta prepara??o de livro aberto mostra o padr?o de express?o dos falc?es como uma constru??o única na placa do piso.

Esta imagem mostra uma imagem de campo brilhante da aplica??o de locais de inje??o de Dai. Em uma prepara??o de livro aberto, Dai foi injetado em um padr?o pontilhado próximo à margem lateral do livro aberto. No lado eletroavaliado, esta imagem mostra a visualiza??o da express?o de GFP na mesma prepara??o, e aqui Dai é visualizado.

Após três dias de difus?o, o relaxamento da comissura nas trajetórias deve poder ser visualizado sob microscopia fluorescente. As trajetórias normais do ax?nio crescer?o em dire??o à placa do piso, cruzar?o a placa do piso e depois girar?o e crescer?o. Aliado como visto aqui.

Fenótipos anormais decorrentes do knockdown de genes, como o mostrado aqui, podem ser comparados à trajetória arquetípica. No exemplo, algum ax?nio paralisando a placa do piso ou tomando decis?es err?neas de giro no lado contralateral. Ao tentar este procedimento, é importante ser cuidadoso e paciente durante as etapas de inje??o fina e disseca??o.

Isso requer alguma prática. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreens?o de como injetar e comer plasmídeos de RNAI para investigar a fun??o do gene durante o desenvolvimento do tubo neural de uma maneira específica do tipo de célula.