W protokole przedstawiono metod? kowalencyjnego przy??czania biotyny do bia?ek in vivo w oparciu o ich blisko?? do ligazy biotyny po??czonej z bia?kiem b?d?cym przedmiotem zainteresowania. Modyfikacja ta pozwala na selektywne wzbogacanie bia?ek za pomoc? kulek streptawidyny, zgodnie z potrzebami w badaniach interakcji bia?kowych.

Pantofelek jest jednokomórkowym eukariontem z dymorfizmem j?drowym. W j?drze linii zarodkowej wiele genów koduj?cych bia?ka jest przerywanych przez sekwencje podobne do transpozonów, które musz? zosta? usuni?te w j?drze somatycznym. Wymaga to kompleksów wielobia?kowych w dynamicznym procesie.

Jedn? ze skutecznych strategii badania tak skomplikowanej maszynerii molekularnej jest biotynylacja zbli?eniowa. W naszym podej?ciu mo?emy wprowadzi? dowolny gen docelowy przed ligaz? turboID, aby stworzy? bia?ko fuzyjne. Nast?pnie konstrukt ten musi zosta? wstrzykni?ty do j?dra somatycznego pantofelka, jak pokazano w poni?szym protokole.

W tym protokole stosowanym obecnie komórki, które zosta?y odzyskane w ?wie?ej po?ywce hodowlanej. U?yj mikroskopu stereoskopowego, aby uchwyci? komórki za pomoc? pipety i przenie?? je do ?wie?ego pola szkie?ka depresyjnego z medium myj?cym. Gdy komórki znajduj? si? w medium myj?cym, rozprowad? 20 mikrolitrów wody na szkie?ku podstawowym i przykryj szk?em nakrywkowym.

Dodaj 200 mikrolitrów oleju mineralnego na wierzch szk?a nakrywkowego. Nast?pnie przenie? poszczególne komórki ze szkie?ka myj?cego w postaci kropelek pod olej mineralny. Umie?ci? przygotowane szkie?ko na cokole mikroskopu iniekcyjnego.

Zamocowa? ig?? do aspiracji i przesun?? j? na miejsce. Aktywuj rami? robota i mikrowtryskiwacz FemtoJet. U?yj końcówki pipety do mikro?adowarki, aby doda? DNA do kapilary ig?y do wstrzykiwań.

Przymocowa? ig?? do wstrzykiwań do systemu iniekcyjnego, a nast?pnie przesun?? j? na miejsce i pod??czy? do wstrzykiwacza FemtoJet. U?yj ramienia robota, aby umie?ci? ig?? do wstrzykiwań wewn?trz kropli wody. Nast?pnie naci?nij czysty, aby oczy?ci? ig??, a? b?dzie widoczny przep?yw DNA.

Przej?? do kropli zawieraj?cej komórk? i opu?ci? ig?? do aspiracji. Nast?pnie delikatnie zasysaj wod?, a? komórka zostanie unieruchomiona. Podnie?? ig?? do aspiracji i opu?ci? ig?? do wstrzykiwań.

Ig?? do wstrzykiwań nale?y wprowadzi? w ciemniejsze miejsce odpowiadaj?ce j?dru somatycznym. Rozlana kropla mo?e sta? si? widoczna w granicach j?dra somatycznego po udanym wstrzykni?ciu. Po wstrzykni?ciu nale?y u?y? ig?y do aspiracji, aby przywróci? wod? do komórki.

Nast?pnie ka?da wstrzykni?ta komórka musi zosta? odzyskana do studzienki wype?nionej po?ywk? hodowlan?. Po namna?eniu komórek nale?y potwierdzi? obecno?? wstrzykni?tego DNA. W przypadku tej procedury zwykle oczekuje si? wska?nika sukcesu od 40 do 50%.

Konieczne jest równie? zweryfikowanie pomy?lnej ekspresji bia?ek z wstrzykni?tego DNA, a tak?e ich prawid?owej lokalizacji za pomoc? barwienia immunofluorescencyjnego. Tutaj pokazujemy udane zastosowanie bia?ka NOVA1 po??czonego z ligaz? biotyny turboID do znakowania zbli?eniowego podczas ró?nych etapów rozwoju w pantofelku. Warto zauwa?y?, ?e suplementacja biotyn? zwi?ksza biotynylacj? w komórkach, które wyra?aj? bia?ko fuzyjne turboID.

Jednak dodanie biotyny do komórek typu dzikiego nie prowadzi do biotynylacji. Zgodnie z oczekiwaniami, biotyna jest kowalencyjnie przy??czona do ró?nych bia?ek, jak wykazano w analizie Western blot. Na koniec u?ywamy kulek magnetycznych pokrytych streptawidyn?, aby wykaza?, ?e biotynylowane bia?ka mog? by? selektywnie wzbogacane z lizatu pantofelka.

Opracowali?my metod? znakowania biotyn? bia?ek in vivo in pantofelcium. Metod? t? mo?na szybko dostosowa? do ka?dego genu, który Ci? interesuje. Biotynylacj? specyficzn? dla danego etapu mo?na osi?gn?? poprzez czas suplementacji biotyn?.