Ten artyku? przedstawia szczegó?ow? procedur? eksperymentaln? odtwarzania nukleosomów DNA dla si?y korelacji pojedynczej cz?steczki i mikroskopii fluorescencyjnej. Dalej opisano kilka dalszych eksperymentów, które mo?na przeprowadzi? w celu wizualizacji zachowania wi?zania bia?ek oddzia?uj?cych z chromatyn? i analizy zmian w?a?ciwo?ci fizycznych nukleosomów.

Techniki jednocz?steczkowe s? pot??nymi narz?dziami do badania mechaniki, koordynacji i sk?adu uk?adów chromatyny, dlatego naukowcy zawsze szukaj? lepszych metod generowania substratów nukleosomów. W tym miejscu opisujemy protokó? tworzenia nukleosomów w poprzek DNA in situ w mikroskopie si?y korelacyjnej i fluorescencji pojedynczej cz?steczki. Zazwyczaj substraty nukleosomów s? wytwarzane przez sk?adanie nukleosomów na DNA zawieraj?cym silne sekwencje pozycjonuj?ce za pomoc? dializy solnej.

Chocia? ma to zalety, generuje sztucznie stabilne nukleosomy i jest ci??ki w odczynnikach. Nasz protokó? przygotowuje substraty nukleosomów do mikroskopii si?owej i fluorescencyjnej skorelowanej z pojedyncz? cz?steczk? bez okre?lonych sekwencji DNA i przy u?yciu znacznie mniejszej liczby odczynników, a wszystko to w ci?gu kilku minut. Protokó? ten umo?liwia sk?adanie nukleosomów na natywnych sekwencjach DNA, ?atw? regulacj? g?sto?ci nukleosomów, a tak?e skrócenie czasu przygotowania i u?ycie odczynników.

Ponadto tworzenie nukleosomalnych p?t DNA in situ umo?liwia prostszy przebieg eksperymentów oraz wygod? wbudowanej wizualizacji i manipulacji pojedynczymi cz?steczkami. Gdy jednolite i specyficzne pozycjonowanie nukleosomów nie jest istotn? cz??ci? eksperymentu, nasze odkrycia mog? pomóc naukowcom w bardziej efektywnym badaniu chromatyny i jej bia?ek wydobywczych na poziomie pojedynczej cz?steczki. Dzi?ki zaoszcz?dzonemu czasowi i zasobom mo?na przeprowadzi? wi?cej eksperymentów w celu dalszego zbadania dodatkowych zmiennych i warunków.

Odpowiednie obszary badawcze, o których obecnie my?limy, obejmuj? mechanik? chromatyny, która jest regulowana przez warianty histonów i inne modyfikacje potranslacyjne. Zastanawiamy si? równie? nad biofizycznymi zaanga?owaniami i kinetyk? innych bia?ek wi???cych chromatyn?. I wreszcie, my?limy równie? o procesach sk?adania wy?szego rz?du nap?dzanych przez nukleosomy, takich jak kondensacja biomolekularna.

Aby rozpocz??, dodaj 500 mikrolitrów bezbia?kowego bufora obrazu do kana?u trzeciego komórki przep?ywowej. Wymieszaj dwa nanomolary Saccharomyces cerevisiae Nap1 i dwa do pi?ciu nanomolowców oktamera histonów H4 znakowanego LD655 z 500 mikrolitrami buforu 1XHR. Dodaj t? mieszanin? do kana?u czwartego komory przep?ywowej.

Przep?yń wszystkie kana?y pod ci?nieniem 1,0 bara przez 30 sekund, aby przep?uka? je próbkami. Ustaw przep?yw na 0,2 bara i przesuń pu?apki optyczne na kana? 1, aby z?apa? odpowiedni? par? kulek pokrytych streptawidyn?. Nast?pnie przesuń pu?apki optyczne na kana? 3.

Wy??cz przep?yw i przeprowad? kalibracj? si?y dla pary koralików. W??cz czerwony laser konfokalny i skalibruj obszar obrazowania. Po ustawieniu przep?ywu na 0,2 bara przesuń pu?apki optyczne na kana? 2, aby wychwyci? biotynylowane DNA.

Nast?pnie przesuń pu?apki optyczne na kana? 3 i zatrzymaj przep?yw. Zwi?ksz odleg?o?? mi?dzy pu?apkami optycznymi, aby rozci?gn?? DNA i monitoruj powi?zan? krzyw? wymuszonej odleg?o?ci, aby potwierdzi? obecno?? pojedynczej uwi?zi DNA. Dostosuj odleg?o?? mi?dzy pu?apkami optycznymi tak, aby napi?cie DNA wskazywa?o oko?o jednego pikonewtonu.

W??cz skanowanie linii, aby rozpocz?? zbieranie kimografu przy w??czonym czerwonym laserze. Nast?pnie przenie? pu?apki optyczne do kana?u 4 z odp?ywem, aby utworzy? nukleosomy wzd?u? uwi?zi DNA. Aby rozpakowa? nukleosomy, przesuń pu?apki optyczne na kana? 3.

Ustawiaj?c odczyt si?y na zero i pr?dko?? na 0,1 mikrometra na sekund?, odsuń pu?apk? optyczn? 1 od pu?apki optycznej 2. Wymieszaj 10 nanomoli histonu ??cznikowego H1.4 znakowanego Cy3 z 500 mikrolitrami bufora obrazu i dodaj do kana?u 5. Po utworzeniu uwi?zi DNA zawieraj?cej nukleosomy, w??cz zielony laser oprócz czerwonego lasera i przesuń pu?apki optyczne do kana?u 5, aby obrazowa? w czasie rzeczywistym wi?zanie H1 z chromatyn?.

Tworzenie nukleosomów wzd?u? uwi?zi DNA zosta?o zwizualizowane jako stacjonarne czerwone ogniska fluorescencyjne na skanie 2D i kimografie. Analiza fotowybielania wykaza?a jednoetapowe lub dwuetapowe zdarzenia fotowybielania, wskazuj?ce na obecno?? mononukleosomów. Pod nieobecno?? Nap1, oktamer histonowy wi?za? DNA, ale pozostawa? w wi?kszo?ci nieowini?ty, na co wskazywa?o ci?g?e napi?cie.

U?ywaj?c H2a znakowanego Cy3, uzyskano podobne wyniki sk?adania nukleosomów, jak w przypadku H4 znakowanego LD655. Odwijanie nukleosomów zwi?ksza?o z czasem odleg?o?? uwi?zi, widoczn? na kimografie, i generowa?o wymuszone krzywe odleg?o?ci z charakterystycznymi rozdarciami, które oznaczaj? odwijanie poszczególnych nukleosomów. Wi?zanie histonu ??cznikowego H1 z chromatyn? by?o wskazane przez zielone ogniska fluorescencyjne z dwukolorowymi trajektoriami stacjonarnymi reprezentuj?cymi wi?zanie H1 z nukleosomami i zielonymi postrz?pionymi trajektoriami reprezentuj?cymi dyfuzyjne trajektorie H1.