1. Wykonanie na zamówienie podstawki do wk?adów do hodowli komórkowych

Podstawa końcówki do pipety 5 ml (ISC BioExpress, #P-3250-19) ma wewn?trzn? ?rednic? 13 mm, która idealnie pasuje do rozmiaru dna (12,6 mm, ?rednica zewn?trzna) wk?adki do hodowli komórkowej NUNC 10 mm (?rednica wewn?trzna) (8 μm, membrana poliw?glanowa, termiczna, #137443). Aby wykona? podstawk?, pipeta zosta?a odci?ta w pobli?u podstawy, aby uzyska? pusty cylinder o d?ugo?ci 6 mm. Nast?pnie za pomoc? rozgrzanego p?omieniem ostrza wyjmowano kawa?ki z boku cylindra, aby utworzy? 3 nogi (o wysoko?ci 4 mm) pod pier?cieniem (o wysoko?ci 2 mm), co podnios?o wysoko?? wk?adek o oko?o 5 mm.

2. Przygotowanie sterylnej bibu?y filtracyjnej do zak?adania i hodowli siatkówki ?wiń

Papier filtracyjny Whatman 4M (nr kat. 1004) zosta? poci?ty na okr?g?y kszta?t (6,3 mm ?rednicy) z ma?ym, trójk?tnym uchwytem, który s?u?y? do przenoszenia bibu?y filtracyjnej do szklanej rurki w celu sterylizacji lub po przymocowaniu siatkówki (jak pokazano na filmie).

3. Przygotowanie eksplantatów siatkówki

Oczy w wieku od 5 do 9 miesi?cy, 150-230 funtów, amerykańskie ?winie Yorkshire zosta?y pozyskane z lokalnej rze?ni w ci?gu trzech godzin od enukleacji (transportu na lodzie). Po przybyciu na miejsce, oczy zosta?y oczyszczone z obcych tkanek, zanurzone w roztworze betadyny (10% jodu powidonu, The Purdue Frederique Company, Stamford, CT) i dwukrotnie przemyte w Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM z 1 g / L glukozy, L-glutamin? i pirogronianem sodu, Cellgro-mediatech Inc., Manasses, VA) uzupe?nionym 2,5 μg / ml Amfoterycyny B (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA). Usuni?to przedni odcinek, ods?aniaj?c siatkówk? nerwow?. Sze?ciomilimetrowe ostrza trepanacyjne (Storz Ophthalmic-Bausch i Lomb, Manchester, MO) by?y u?ywane do ci?cia równikowych, pe?nej grubo?ci eksplantatów tylnych segmentów. Siatkówka zosta?a nast?pnie odklejona poprzez delikatne na?o?enie kawa?ka suchej sterylnej bibu?y filtracyjnej na warstw? komórek zwojowych, uniesienie siatkówki nerwowej i umieszczenie bibu?y filtracyjnej z do??czon? siatkówk? na wk?adce hodowlanej, fotoreceptorami skierowanymi do góry. Wk?adk? umieszczono nast?pnie w po?ywce hodowlanej, upewniaj?c si?, ?e ca?kowicie pokry?a siatkówk?, w 12-do?kowym naczyniu hodowlanym (Fisher). Wiele eksplantatów uzyskano rutynowo i wyhodowano z jednego oka.

4. Hodowla tkankowa

Tkanka siatkówki zosta?a wyhodowana w Eagle's Minimum Essential Medium (MEM, Invitrogen-Gibco-Life Technologies Inc., Rockville, MD), pH 7,4, uzupe?nione 0,2 mg/ml glutaminy, 10 μg/ml insuliny wieprzowej, 1 mM pirogronianu, 0,1 mM kwasu L-askorbinowego, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 250 ng/ml amfoterycyny B (antybiotyk przeciwgrzybiczy: Sigma, St. Louis, MO) i napowietrzane nawil?onym 5% powietrzem wyrównawczym CO₂ w temperaturze 37 °C. Po?ywk? wymieniano co dwa dni.

Tkanka mo?e by? u?yta, potraktowana ró?nymi odczynnikami lub sondami, lub pozostawiona bez leczenia do pó?niejszych analiz biochemicznych lub morfologicznych. W poni?szej sekcji opisano procedury tworzenia spójnych przekrojów siatkówki o pe?nej grubo?ci.

5. Podzia? na sekcje

1. Korzystanie z kriostatu
   1. Utrwali? tkank? siatkówki w 4% parafomaldehydzie przez noc w temperaturze 4°C;
   2. Krótko przep?uka? tkank? sol? fizjologiczn? buforowan? fosforanami (PBS);
   3. Ostro?nie usun?? tkank? z bibu?y filtracyjnej, gdy znajduje si? ona w PBS w naczyniu o ?rednicy 35 mm, za pomoc? mikroskopu preparacyjnego;
   4. Przenie? tkank? do 30% sacharozy i trzymaj przez noc w temperaturze 4°C;
   5. Odessa? nadmiar roztworu wokó? tkanki, doda? wystarczaj?c? ilo?? po?ywki Tissue-Tek (O.C.T. Compound 4583) do pokrycia tkanki i pozostawi? do namoczenia w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, aby przenikn?? do tkanki;
   6. Zbuduj kwadratow? ramk? (10 mm x 10 mm, 5 mm wysoko?ci) z woskiem dentystycznym i umie?? j? wokó? tkanki; dodaj wi?cej po?ywki Tissue-Tek, aby wype?ni? ramk? (upewnij si?, ?e próbka tkanki jest p?aska) i umie?? w zamra?arce (-20°C) na co najmniej 1 godzin?;
   7. Przenie? zamro?ony blok próbki na platform? z próbk? (upewnij si?, ?e blok próbki jest ustawiony pionowo w stosunku do platformy);
   8. Zamontuj platform? próbki we wst?pnie sch?odzonym kriostacie (-20°C, Leica, CM1900) i upewnij si?, ?e blok jest ustawiony pionowo do ostrza;
   9. Usuń wosk i blok ramy przed poci?ciem tkanki na ??dan? grubo??;
   10. Umie?? skrawki na szkie?kach nas?czonych ?elatyn?.
2. Korzystanie z wibratomu
   1. Napraw i wyp?ucz tkank? zgodnie z powy?szym opisem dla kriostatu;
   2. Umie?? tkank? w podgrzanym, stopionym 4% agarze w ma?ym pojemniku i trzymaj w temperaturze 4°C, a? agar ca?kowicie zastygnie;
   3. U?yj ostrego ostrza, aby przyci?? agar do ma?ego bloku z próbk? tkanki w ?rodku;
   4. Przyklej blok próbki do wibratomu za pomoc? kleju Krazy (upewnij si?, ?e kawa?ek próbki tkanki jest pionowo do platformy uchwytu próbki, tj. prostopadle do ostrza) i zamontuj uchwyt na systemie do ci?cia wibratomu (Leica, seria 1000) z blokiem próbki ca?kowicie zanurzonym w lodowatej wodzie;
   5. Poci?? blok próbki na odcinki o d?ugo?ci 50 μm i umie?ci? je na szkie?kach nas?czonych ?elatyn? za pomoc? mi?kkiej szczotki.

6. Immunohistochemia

U?yj dowolnego standardowego protoko?u. Grube skrawki znakowane immunologicznie mo?na ogl?da? pod mikroskopem konfokalnym.

7. Reprezentatywne wyniki:

Morfologia zosta?a zachowana podczas siedmiodniowego okresu hodowli. Zdj?cia siatkówki przed i po hodowli s? dost?pne w filmie.

Vision researchers have established a variety of retinal culture systems, including organotypic systems, to study a variety of issues, such as retinal stem cell transplantation¹, retinal regeneration², and exogenous gene expression^3-5. However, adult mammalian retina is difficult to maintain in vitro, mainly due to the high-energy demands of the photoreceptors⁶. Koizumi et al. described a rabbit retinal organotypic culture system in which the oxygen supply for photoreceptors was ameliorated by raising the height of the culture insert and agitating the culture medium. They successfully maintained adult retinal tissue for up to six days^4,5. Kobuch et al. described a perfusion culture system for adult porcine retina and retinal pigment epithelium (RPE) and were able to maintain the organotypic tissue for at least 10 days⁷. However, the procedure for preparing the retina-RPE-choroid sheets for laboratory manipulation was complicated and required special tools. In addition, each explant required its own perfusion system making in vitro culture of multiple tissue samples cumbersome. Kaempf et al. successfully created another organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with RPE but only showed results for a 3-day culture; the long-term survival of the tissue was not tested⁸.

In this manuscript, we describe a simple and reproducible protocol for organotypic culture of adult porcine neural retina adopting an approach similar to that previously described for rabbit retina⁴ with the following features:

1. Creation of a simple technique to make a custom stand to raise the height of the culture insert, ensuring good oxygen supply for the whole retina explant. Using a 5 ml pipette tip to create the stand assures that the stand can be autoclaved and that the height can be adjusted if desired.
2. Culture of the retina with the photoreceptor layer facing upwards, as opposed to the ganglion cell layer. In this way, the photoreceptors have increased access to oxygen, and agitation to further boost the oxygen supply is not necessary.
3. Minimization of mechanical trauma. The retinal explants are attached to sterile filter paper before peeling them from the RPE and then are cultured on the filter paper, thereby reducing mechanical stress on the tissue and preventing retinal curling.
4. Consistency in the size of retinal explants. Because a trephine is used to create the explants, each retinal explant is of the same size, thereby making it easy to compare the results of various treatments.
5. Preservation of morphology. Structure of the porcine retina in this culture system remains intact for at least seven days.

Given that porcine and human retina are very similar in terms of cell distribution and morphology, vascular pattern, layer thickness, and other physiologic characteristics^9,10, the organotypic culture of porcine retina provides an attractive animal model for studying manifestations of human retinal diseases, degenerations, and injuries. This system may be particularly important in cases where in vitro experiments on human retina are impossible to perform due, in part, to the lack of high-quality human tissue.