Transfiera un trozo de tejido cerebral humano fresco congelado a un molinillo adecuado que contenga tampón de lisis fría.

Mueva el mortero hacia arriba y hacia abajo para romper mecánicamente el tejido, liberando las células.

Las moléculas de detergente en el tampón de lisis rompen la membrana celular, liberando los núcleos.

Transfiera el contenido a un tubo de centrífuga adecuado y agregue tampón de sacarosa fría al fondo del tubo, creando un gradiente de densidad.

Centrifugar a alta velocidad para separar los núcleos en el fondo del tubo.

Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los núcleos en una solución salina tamponada.

Agregue anticuerpos conjugados con fluoróforos específicos de la diana a los núcleos e incube para permitir que el anticuerpo se una a su proteína nuclear diana.

Agregue tinción nuclear para visualizar el ADN intacto.

Realice la clasificación de núcleos activados por fluorescencia para clasificar los núcleos de diferentes poblaciones celulares en función de distintas se?ales de fluorescencia.

Comience a diseccionar aproximadamente de 200 a 400 miligramos de tejido de una muestra de tejido de corteza adulta humana fresca y congelada. Coloque el pa?uelo en un cortador de papel tisú de vidrio de 7 mililitros que contenga 4 mililitros de tampón de lisis helado en hielo y muela el tejido aproximadamente 50 veces.

Transfiera el homogeneizado a un tubo de polipropileno ultracentrífugo de 12 mililitros. Utilice una pipeta de 5 mililitros para a?adir 6,5 mililitros de tampón de sacarosa helada al fondo del tubo de ultracentrífuga sin alterar la interfaz entre la sacarosa y el homogeneizado de tejido.

Para recolectar los núcleos, ultracentrifugar el lisado durante una hora a 101,814 veces g y aspirar cuidadosamente el sobrenadante y los desechos sin alterar el sedimento. Agregue PBS al tubo de ultracentrífuga, resuspendiendo el sedimento de núcleos.

Para la clasificación activada por fluorescencia de los núcleos aislados, agregue aproximadamente 20 microlitros de la muestra resuspendida a una solución de anticuerpos que contenga anticuerpo anti-NeuN de ratón conjugado con AlexaFlour555. Agregue aproximadamente 20 microlitros de la muestra resuspendida a una solución de anticuerpos que contenga anticuerpos anti-PAX6 de ratón conjugados con APC. Después de una incubación de una hora, a 4 grados centígrados con agitación protegida de la luz, agregue DAPI en una proporción de 1 a 1,000 a todas las muestras y controles.