Tomemos una rata sacrificada.

Abra el abdomen, extirpe la vejiga y sumérjala en un tampón.

Abra la vejiga y elimine la grasa adherida y los restos de tejido.

Transfiera la vejiga a un tubo que contenga tampón, centrifugue y retire los desechos.

Coloque el tejido en una solución que contenga colagenasa y píquelo. Agregue más colagenasa para degradar la matriz extracelular, aflojando las células.

Centrifugar y desechar el sobrenadante. Agregue tripsina para interrumpir las uniones célula-célula, liberando las células.

Agregue un medio de enjuague que contenga proteínas para inactivar la tripsina, luego centrifugue y elimine el sobrenadante.

Vuelva a suspender las celdas en el medio; fíltrelas para eliminar agregados y obtenga una suspensión de una sola celda.

Centrifugar y eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender las celdas en el medio.

Coloque las células en cubreobjetos recubiertos para facilitar la unión de las células neuronales y gliales. Retire las celdas no adheridas.

Agregue medios neuronales que contengan factores de crecimiento para promover la maduración celular, estableciendo un cultivo neuronal y glial primario.

Comience colocando ratas en una toalla quirúrgica esterilizada y exponiendo el abdomen. Use tijeras y fórceps para abrir la cavidad abdominal y revelar la vejiga. Use otro juego de tijeras y fórceps para levantar suavemente la vejiga y cortarla del cuello de la vejiga.

Luego, coloque rápidamente la vejiga en una solución de Krebs fría y estable al oxígeno para mejorar la supervivencia celular. Agregue la solución de Krebs en tres platos de vidrio y tres vasos de vidrio y colóquelos en un ba?o de hielo para que se enfríen previamente. Numere los platos y vasos de precipitados 1, 2 y 3 para evitar confusiones.

En el plato de vidrio 1, abra la vejiga con unas tijeras oftálmicas y despliéguela con fórceps y un divisor de núcleo de cucharas. Enjuague la vejiga en un vaso de vidrio 1 y colóquela en un plato de vidrio 2. Elimine la grasa adherida en la superficie del tejido con las pinzas y las tijeras oftálmicas. Luego, enjuague la vejiga en el vaso de precipitados 2 y colóquela en el plato 3.

Raspe suavemente la vejiga con las pinzas y el divisor de núcleo de la cuchara para eliminar las uniones exógenas. Enjuague la vejiga en un vaso de precipitados de vidrio 3 y transfiérala a un tubo de centrífuga de 15 mililitros con 14 mililitros de solución fría de Krebs. Centrifugar la muestra durante 1 minuto a 360 veces g y 4 grados centígrados.

Transfiera la vejiga del tubo de centrífuga a un vial de 2 mililitros que contenga 1 mililitro de solución de digestión. Use tijeras oftálmicas para cortar la vejiga en pedazos peque?os. Mezcle la solución de vejiga con 9 mililitros de solución de digestión 1 en una placa de cultivo celular estéril. Realice la primera digestión en una incubadora agitadora durante 1 hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono a 200 RPM. Después de la primera digestión, centrifugar la solución a 300 veces g y 4 grados centígrados durante 8 minutos.

Mientras tanto, coloque la solución de digestión 2 en un ba?o de agua a 37 grados Celsius para precalentar. Después de la centrifugación, retire la mayor parte del sobrenadante que contiene la solución de digestión 1, dejando un poco de sobrenadante para evitar la pérdida de células.

Vuelva a suspender las células en la solución de digestión tibia 2 y agite la mezcla mientras digiere en un ba?o de agua a 37 grados centígrados durante 5 minutos. Una vez que se complete la digestión, desactive inmediatamente la tripsina agregando 10 mililitros de medios de enjuague frío. Centrifugar las células a 360 veces g y 4 grados centígrados durante 8 minutos. Luego, elimine la mayor cantidad posible de sobrenadante para eliminar toda la tripsina.

Vuelva a suspender suavemente el sedimento con 3 mililitros de medio neuronal, asegurándose de no generar burbujas de aire en la solución. Filtre la suspensión a través de un filtro de celdas de 70 micrómetros en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Recoger células por centrifugación a 360 veces g a 4 grados centígrados durante 8 minutos. Luego, vuelva a suspender suavemente los gránulos celulares en 1 mililitro de medio neuronal A y agregue 500 microlitros de suspensión celular a cada pocillo de una placa de 48 pocillos. Cultive células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.